造血干细胞分离纯化和体外扩增

关于造血干细胞

造血干细胞是一种原始未分化的细胞，具有自我更新能力和分化为各类血细胞的潜能。它们负责持续生成红细胞、白细胞、血小板等，维持人体血液系统的正常功能，是治疗血液疾病、免疫缺陷及某些癌症的关键生物资源。

骨髓是造血干细胞的主要来源，尤其在成年个体中。骨髓中含有大量造血干细胞，具有长期自我更新和分化成各类血细胞的潜能。骨髓移植是最早应用的造血干细胞移植形式，其优点是干细胞数量充足且植入成功率较高。通过注射粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等动员剂，可将骨髓中的造血干细胞释放到外周血中，再通过血细胞分离机采集。外周血干细胞移植无需手术，是目前应用广泛的移植物来源，具有造血重建快、抗白血病效应强的特点。‌‌脐带血含有丰富的造血干细胞，采集过程对母婴无伤害。脐带血干细胞免疫原性低，HLA配型要求相对宽松，适合儿童及部分成人移植，但干细胞数量有限可能影响植活成功率。‌‌

造血干细胞的分离和纯化

造血干细胞的分离纯化是从混合细胞群（如骨髓、外周血或脐带血）中特异性获取高纯度、高活性造血干细胞（HSCs）的关键技术。其核心原理是基于HSCs有的表面标志物CD34，通过物理特性和免疫学方法进行分选。

1.样本制备：将来源组织（如骨髓、外周血、脾脏）制备成单细胞悬液，并通过密度梯度离心初步富集单个核细胞（MNCs）。

2.细胞标记：将细胞重悬于冰冷的、含Fc阻断剂的分离缓冲液中，以阻止抗体通过Fc受体非特异性结合。

3.加入适量偶联了磁珠的特异性单克隆抗体。

4.在4°C下避光孵育30min。

5.洗涤与重悬：用分离缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合的游离磁珠和抗体，最后将细胞重悬于适量分离缓冲液中。

6.上样与分选：将分选柱放入强磁场中，用缓冲液润洗柱子后，将细胞悬液缓慢加入柱中。

7.阴性细胞在重力或加压下直接流出，被收集。

8.用缓冲液多次冲洗柱子，确保所有阴性细胞被充分洗掉。

9.阳性细胞洗脱：将分选柱移出磁场，立即向柱中加入适量缓冲液，并用柱塞施加压力，将强烈吸附在柱内的磁性标记细胞快速冲洗下来并收集。

10.分析与验证：通常取部分分选前后的细胞，通过流式细胞术检测CD34+细胞的纯度和回收率。

造血干细胞的体外培养

1.将分离纯化出的造血干细胞进行收集，通过台盼蓝染色法对细胞进行细胞计数和活率计算。

2.按照说明书进行造血干细胞培养液的配制：将Kit中的“造血干细胞扩增添加剂"和“CD34+扩增用分化抑制剂"加入至人源化干细胞培养基中，轻柔混匀，备用。

3.用上述培养液对细胞进行重悬，最终将造血干细胞按照1×10^5 cells/mL接种密度接种至合适的培养容器中，37℃、5%CO2静置培养。

4.之后每2-3天镜下观察细胞，适时进行传代和流式检测。