SDS-PAGE凝胶电泳实验

当电泳开始后，在这个pH条件下缓冲液中的HCl的Cl-几乎全部解离，Gly解离出少量的甘氨酸根离子（Gly等电点为6.0，因此仅有少数解离为负离子）。由于蛋白质分子在前处理后带负电荷，因此在电场中和Cl-及甘氨酸根离子一起向正极移动。在电场移动过程中，Cl-移动最快，蛋白质分子居中，甘氨酸根离子移动最慢，三类离子的迁移速率为Cl->蛋白质分子>甘氨酸离子。电泳开始后，Cl-泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。甘氨酸离子在电场中移动最慢，造成移动离子的缺乏，于是Cl-和甘氨酸根离子之间就形成了一个缺少离子的高压区，具有较高的电场强度。在这高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl-区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，按照电荷大小排列。但是由于目标蛋白都带有负电荷，所以位于同一的起点，这样就起到了浓缩的作用。

从上层的浓缩胶进入下层的分离胶后，胶的pH变高，Cl-电离从而达到正极，甘氨酸根离子的电离度增大，泳动率上升，很快就会跑超所有蛋白质分子，紧跟在Cl-后达到正极，此时低离子浓度不再存在，分离胶中形成了一个恒定的电场强度。而这时还有蛋白质分子在分离胶中进行着缓慢的移动。根据蛋白质分子受到溶液离子的影响导致pH发生变化，但因为所带电荷数的单位质量不同，所以带负电荷多的移动快，反之则慢，这就有了电荷效应。由于分离胶的孔径大小差异，从而形成了一个整体的筛网结构，对不同分子大小的蛋白质来说，通过移动时受到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，最终也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。这样就起到了分子筛作用。

一、蛋白样品的制备

1、试剂准备

5×loading buffer（以100mL为例）

配置方法：先SDS在1M Tris·Hcl中溶解，等待SDS溶解后加入其余物质。

2、实验步骤

将待测蛋白样品与5×loading buffer按照4：1的比例混合，100℃煮沸10min。

3、原理

蛋白样品制备的核心目标是：将复杂的蛋白质混合物变性、还原和溶解，使其成为均一的、带强负电荷的线性分子，从而确保其在后续电泳中的迁移率仅与分子量相关。这个过程主要依赖于上样缓冲液的作用，其各个成分分工明确：

a.SDS - “破坏者"与“充电器"

1）破坏结构：作为强阴离子去垢剂，SDS能破坏蛋白质分子的氢键和疏水相互作用，摧毁其二级和三级结构，使蛋白质去折叠。

2）均匀电荷：SDS会与蛋白质的疏水区域结合，大约每克蛋白质结合1.4g SDS。形成的“蛋白质-SDS复合物"携带了大量的负电荷，掩盖了蛋白质自身所带的电荷差异。这使得所有蛋白质的“电荷-质量比"近乎相同。

b.还原剂 - “剪刀手"

切断二硫键：常用的还原剂如β-巯基乙醇 或二硫苏糖醇，能够断裂蛋白质分子内和分子间的二硫键，将蛋白质亚基分离开来，破坏其三级或四级结构。

c.加热 - “加速器"

促进反应：100℃煮沸5-10分钟 为SDS和还原剂的作用提供能量，极大地加速蛋白质的变性和还原过程，确保所有蛋白质分子快速地线性化。

d.上样缓冲液中的其他辅助成分

1）甘油：增加样品密度，使样品在点样时能沉入加样孔底部，防止飘散。

2)溴酚蓝：一种小分子染料，作为电泳前沿的指示剂，让我们可以直观地观察电泳进程。

3)Tris-HCl缓冲液：提供稳定的pH环境（通常为pH 6.8），确保反应在最佳条件下进行。

4、关键注意事项

1）样品与上样缓冲液的比例

黄金比例：通常使用 4:1 的比例混合样品和 5×Loading Buffer。务必计算准确并充分混匀，确保最终浓度为 1×。浓度过高会导致条带扭曲，过低则蛋白可能变性不完整。 

2）防止蒸发：如果使用PCR管或离心管，建议在加热前短暂离心，将液体收集到管底，并盖上管盖，以防止样品蒸发浓缩，甚至烧干。

3）冷却后离心：煮沸后，务必在点样前进行短暂离心（例如，10,000-12,000 rpm，1分钟），将管壁和盖上的冷凝水珠离下，并收集所有样品，确保点样量的准确性。

 4）还原剂的稳定性

β-巯基乙醇易氧化：它很容易被空气氧化而失效。务必密封保存，并定期更换新试剂。如果发现实验效果变差，这是首要排查对象。

5）样品的处理与保存

避免反复冻融：制备好的蛋白样品应在 -20℃ 或 -80℃ 长期保存。为避免蛋白降解，建议分装成小份冻存，每个小份只使用一次。

6）使用前处理：从冰箱取出的冻存样品，应在室温或37℃水浴中溶解并混匀，然后短暂离心后再点样。直接点样冻存样品可能导致浓度不准和条带不均一。

二、浓缩胶与分离胶的制备

1、试剂准备

①30%丙烯酰胺溶液

②10%SDS溶液

③10%过硫酸铵溶液

④1.0M Tris（pH6.8）

⑤1.5M Tris（pH8.8）

2、浓缩胶与分离胶的配置

3、实验步骤

（1）检漏：取两个干净的玻璃板（一个短板-带凹槽，一个长板），将两块板对齐，放在制胶架上，并固定卡紧，两侧一致，然后在两侧玻璃板间加水后静置10min，查看是否漏夜。如果不漏液，把水倒掉，如果漏液，重新组装，继续检漏。

（2）制胶：根据蛋白分子量选择合适的分离胶，按照配方进行配胶，除TEMED外的所有成分加入后，混匀，在灌胶前再加入TEMED。

（3）灌胶：将配制的下层胶灌入两块玻璃板之间，高度可以用梳子定位，大概是梳子下面1cm即可。轻轻晃动，使页面水平，用水封胶，待下层胶凝固后把水倒掉，继续配制上层胶，同样，混匀，灌胶，插梳子，注意避免气泡的产生，待胶凝固后，拔出梳子，放置待用。

4、原理：为什么不连续系统如此高效？

不连续系统之所以比单一胶（连续系统）高效，在于它通过两层不同pH值和孔径的凝胶，巧妙地实现了对蛋白质的 “先浓缩，后分离"。 

1）分离胶 - “分子筛"

作用：基于分子量大小分离蛋白质。

原理：pH环境：高pH（~8.8）的Tris-HCl缓冲液。

凝胶浓度：较高（通常6%-15%），孔径小，形成致密的网状结构。

工作机制：当线性化的SDS-蛋白质复合物进入分离胶时，小分子蛋白质更容易通过凝胶网络，跑得快；大分子蛋白质受到更大的阻力，跑得慢。这种“分子筛效应"使得蛋白质按其分子量大小被分离开。

2）浓缩胶 - “压缩器"

作用：在进入分离胶之前，将稀薄的蛋白质样品压缩成一条极窄的起始区带。

原理：这是整个设计的精华，依赖于三种不连续性：

a.凝胶孔径不连续性：浓缩胶浓度低（通常5%），孔径大，对蛋白质几乎没有阻力。这为蛋白质的快速堆积提供了物理空间。

b.pH不连续性：浓缩胶的pH为~6.8。

c.离子不连续性：系统中的三种离子是关键：

•          Cl⁻ （来自凝胶中的Tris-HCl）：迁移速率最快，称为 “前导离子"。

•          甘氨酸根离子 （来自电泳缓冲液）：在浓缩胶的pH 6.8环境下，甘氨酸（pI~6.0）仅有少量电离，迁移速率最慢，称为 “尾随离子"。

•          蛋白质-SDS复合物：携带大量负电荷，迁移速率介于两者之间。

浓缩过程的动态演绎：

通电后，快离子（Cl⁻）迅速向前移动，离开了它原本所在的区域。

慢离子（甘氨酸根）在后面缓慢移动，导致快慢离子之间形成了一个 低离子强度、高电场强度的区域。

在这个高电场区域中，所有带负电的颗粒（包括蛋白质）都会被迫加速移动。

然而，当蛋白质加速追上快离子（Cl⁻）区域时，那里的电场强度恢复正常，蛋白质速度立刻慢下来。

结果就是，所有的蛋白质分子被“夹在"快慢离子之间，不断地被压缩、堆积，直到它们进入分离胶界面，形成一个极其狭窄的区带。

3）界面效应 - “角色转换"

当蛋白质和甘氨酸根离子到达浓缩胶与分离胶的界面时，环境pH突然从6.8变为8.8。甘氨酸在此pH下大量电离，迁移率急剧增加，迅速跑超所有蛋白质，紧跟着Cl⁻向前移动。

后果：高电场区域消失，所有的蛋白质分子在分离胶的同一“起跑线"上，开始纯粹基于分子量进行分离。

5、关键注意事项

制备凝胶是SDS-PAGE中最需要技巧和耐心的环节，任何疏忽都可能导致实验失败。

1）凝胶浓度的选择

根据目标蛋白分子量选择：低浓度胶（如8%）利于分离大分子蛋白，但小分子蛋白可能会跑出胶；高浓度胶（如15%）利于分离小分子蛋白，但大分子蛋白可能无法进入分离胶。

不确定时：使用 10%或12% 的分离胶是一个普适性较好的选择。

2）配胶操作

a.TEMED 对空气敏感，应密封保存。

b.过硫酸铵溶液最好现用现配，或小分装于-20℃保存，因为它在水溶液中会迅速降解失效。

c.加入顺序：应最后加入这两者，一旦加入，需快速混匀并立即灌胶，否则会开始在管内聚合。

d.混匀：轻柔但地混匀，避免引入过多气泡。

e.水封：灌完分离胶后，必须立即用无水乙醇或异丙醇封顶。这可以隔绝空气（氧气会抑制聚合），并压平胶面。倾斜制胶架使其成斜面，缓慢加入，可以形成更平整的界面。

3）聚合控制

聚合时间：分离胶通常在15-30分钟内聚合。如果聚合过快（<5分钟），可能是TEMED/AP过量，会导致凝胶过硬、易碎；如果聚合过慢（>30分钟），可能是TEMED/AP失效或量不足，或室温过低。

聚合判断：在醇封层和凝胶之间会出现一条清晰的折射线，这表明凝胶已聚合。

4）浓缩胶制备

倒掉封层液：在灌浓缩胶前，必须倒掉分离胶上的醇封层，并用滤纸吸干残留液体，否则会影响浓缩胶的聚合和界面形状。

插梳子：

梳子需保持 绝对水平，否则加样孔深度不一。

缓慢倾斜插入，以最大限度避免气泡。如果产生气泡，可轻轻拔起梳子，重新插入，或用电泳液冲洗孔道将其赶出。

拔梳子：聚合完成后， 轻柔地、垂直向上 拔出梳子。拔得太快或太歪可能撕裂加样孔底部，导致点样时漏液。

5）检漏

这是绝对不能省略的步骤！组装好玻璃板后，加水检漏10分钟，确保制胶架和玻璃板密封良好。否则灌胶后会发生泄漏，浪费试剂和时间。

6）安全须知

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性物质，可通过皮肤吸收。配制母液和操作时务必佩戴手套，并在通风橱内称量粉末。

三、凝胶电泳

1、试剂准备

10×running buffer

使用方法：使用时，取100mL 10×running buffer，加水定容至1000mL，即1×running buffer。

2、实验步骤：

（1）点样：在电泳槽中加入电泳液，没过凝胶，用移液器将蛋白样品和Marker依次加入凝胶孔中，样品每孔可加入20-30μL（总蛋白量20-100μg），Marker可加入5μL预染Marker，记录顺序。

（2）电泳：盖上上盖和导线，设定电压电流开始电泳，待溴酚蓝到达电泳槽底部，停止电泳，约1h。一般浓缩胶电压为80V，等待溴酚蓝进入分离胶后，调整电压至120V，直至溴酚蓝到达凝胶底部。注意正负极连接正确。

3、原理

1）电场驱动与电荷效应

a.动力来源：在电泳槽两侧施加直流电压，形成一个恒定的电场。

b.迁移方向：由于蛋白质在SDS处理后携带大量负电荷，它们会从负极（阴极，通常为黑色插头）向正极（阳极，通常为红色插头）迁移。

c.统一驱动力：所有蛋白质-SDS复合物具有大致相同的“电荷-质量比"，因此它们在电场中受到的初始驱动力是相同的。

2）指示剂 - 溴酚蓝

溴酚蓝是一个小分子染料，它也结合SDS带上负电。

它在凝胶中的迁移速率比绝大多数蛋白质都快，因此可以作为 “电泳前沿"。

当溴酚蓝迁移到凝胶底部时，表明电泳即将结束，此时大部分蛋白质（分子量通常>10 kDa）已在凝胶中得到了充分分离。

4、关键注意事项

1）电泳缓冲液

a.正确稀释：必须使用 1× 的工作浓度。10×储存液需准确稀释，浓度过高会导致产热过多，过低则导电性差、迁移慢且条带扩散。

b.重复使用：电泳缓冲液可以重复使用2-3次，但次数过多会导致离子强度下降、pH变化，影响结果稳定性。如果发现条带异常或电泳时间显著延长，应更换新缓冲液。

2）点样

a.记录顺序：点样前务必在实验记录本上画好点样顺序图，并在凝胶上做好标记（如切掉一角），防止混淆。

b.轻柔准确：将枪头伸入加样孔底部，缓慢、平稳地将样品推出。动作太快或太深会刺破胶孔底部，或将样品冲入相邻孔道，导致交叉污染。

c.空白孔处理：如果有未使用的加样孔，应加入等体积的 1×Loading Buffer 以防止邻近条带扩散。

3）电泳参数设置

a.电压选择：一般采用恒压模式。

b.浓缩胶阶段（80V）：低电压可以使蛋白质在浓缩胶中缓慢、充分地堆积，形成锐利的条带。电压过高会导致堆叠不充分，条带变宽。

c.分离胶阶段（120V-150V）：进入分离胶后，可提高电压以缩短时间。但电压并非越高越好，过高的电压会导致：

d.产热过多：玻璃板烫手，热量会使蛋白质变性、条带出现“微笑"效应（中间快两边慢）。

e.条带扩散：迁移过快，分子筛效应不充分，分离效果差。

f.冷却：如果实验室条件允许，在电泳槽周围放置冰盒或使用冷却循环水装置，可以有效地散热，允许使用稍高的电压同时获得更好的结果。

4）电泳进程监控

a.观察染料：密切关注溴酚蓝的位置。当其跑至凝胶底部约0.5-1cm时，即可停止电泳。

b.防止跑过头：如果小分子蛋白是目标，需在溴酚蓝流出凝胶前停止，否则目标蛋白可能已丢失。

c.观察Marker：如果使用预染Marker，可以直观地看到不同分子量蛋白的分离情况，便于控制电泳时间。

5）安全操作

a.连接电极：务必确保红对红，黑对黑（正极对正极，负极对负极）。接反会导致样品向反方向跑出凝胶，实验失败。

b.防止触电：在连接或拆卸导线、打开电泳槽盖前，务必关闭电源。电泳液是导电的，操作不慎有触电风险。

c.检查漏液：组装电泳槽后，确保内槽和外槽都加入了足够的缓冲液，并且没有漏液现象。

四、染色与脱色

1、试剂准备

①染色液

②脱色液

2、实验步骤

（1）染色：将制胶板取下，割去浓缩胶，将分离胶轻轻放入染色槽中染色，染色大概20-30min。

（2）脱色：染色完成后，回收染色液，用纯净水冲洗凝胶2-3次，然后放入脱色槽中，加入脱色液进行脱色，直到没有背景色为止。

这个过程的核心是让蛋白质条带显色，并通过去除背景色来增强对比度。传统的方法是考马斯亮蓝染色法。

3、原理

1）染色原理 - “特异性结合"

a.染料：考马斯亮蓝 G-250 或 R-250 是常用的染料。它们是一种有机化合物，本身在酸性条件下呈棕红色。

b.结合机制：

范德华力与疏水作用：在酸性甲醇/乙酸环境中，考马斯亮蓝染料上的疏水部分会与蛋白质的疏水区相结合。

静电引力：染料分子上的磺酸基团带负电，会与蛋白质氨基酸残基（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸等）上带正电的基团发生静电吸引。

c.颜色转变：当染料与蛋白质结合后，其最大吸收峰会发生位移，从棕红色变为蓝色。这种结合是化学计量的，即在一定的浓度范围内，结合的染料量与蛋白质的量成正比，这就是半定量分析的基础。

d.简单来说，染色就是将蓝色的染料“刷"在凝胶上，染料会特异性地“粘"在蛋白质条带上，而不会“粘"在空的凝胶上。

2）脱色原理 - “解离与扩散"

a.目的：去除背景中非特异性吸附在凝胶空白处的染料，使蓝色的蛋白质条带在透明的背景下清晰地显现出来。

b.甲醇：作为固定剂，能防止蛋白质在脱色过程中从凝胶中扩散出去，同时也能帮助溶解和洗脱未结合的染料。

c.冰醋酸：提供酸性环境，维持染料与蛋白质结合的稳定性（确保条带不褪色），同时也能帮助溶解和洗脱游离染料。

d.水：作为溶剂，通过浓度差促进染料从凝胶内部向外部溶液扩散。