带你认识流式细胞术PART 4
更新时间：2025-12-17
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流式分析的应用-细胞群比例测定
测定某细胞群体或者亚群的比例是流式细胞术最基本的应用，完成细胞群比例测定需要解决以下两个问题。
问题1：
明确总体是什么，若要测定CD4 T细胞的比例，就首先要明确这个比例是相对于哪一个总体而言的，是占所有T细胞的比例还是占所有淋巴细胞的比例，总体是根据实验具体要求决定的；
问题2：
明确这个细胞群体的特征表型（相对于总体细胞有什么特点），一般来说就是明确这个细胞群体相对于总体内的其他细胞具有或者缺少哪个特征性的抗原，利用该抗原的相应荧光素偶联抗体，就可以进行比例测定。
操作
明确总体和细胞群体的特征表型，先将总体设门（将总体所有细胞显示于一张流式图中），根据细胞群的特殊表型圈出该细胞群，就可以得出比例。
| 细胞群体 | 特征表型 |
| 造血干细胞 | Lin-CD34+CD38-（人）、CD117+（小鼠） |
| 免疫细胞 | CD45+ |
| T细胞 | CD3+ |
| CD4 T细胞 | CD3+CD4+ |
| CD8 T细胞 | CD3+CD8+ |
| 初始T细胞 | CD44 low CD62L high |
| 调节性T细胞 | CD4+CD25+Foxp3+ |
| B细胞 | CD19+或CD20+或CD45R+ |
| NK细胞 | NK1.1+（小鼠C57BL/6系）、DX5+（小鼠）、CD56+（人） |
| NKT细胞 | CD3+ TCRβ+ |
| 单核细胞 | CD14+ |
| 巨噬细胞 | CD11b+、F4/80+（小鼠） |
| 中性粒细胞 | Gr-1+CD11b+（小鼠）、CD11b+CD15+（人） |
| 树突状细胞 | CD11c high MHC二型+ |
流式分析的应用-表型测定
表型就是某种细胞表达一些重要抗原分子的情况，明确细胞表达这些抗原分子的情况就可以从一定程度上判断这群细胞的某些特征，而且也可以从一定程度上判断这群细胞的功能状态。表型测定也需要解决以下两个问题。
问题1：
明确测定哪个细胞群的表型，然后标记该特征表型的荧光素偶联抗体（或标记其他细胞间接反映待测细胞，例3种细胞，待测细胞AB，其他细胞AC、BC等等）；
问题2：
明确需要测定哪个或者哪些表型，然后标记需要测定的这些表型的荧光素偶联抗体（若表型较多，可以将样品均分，标记不同抗体检测）；
操作
先根据细胞群特征表型（一般是对应荧光素偶联抗体所接收的通道）设门，将其显示于一个流式图中（流式图中一个轴代表一个需要检测的表型荧光信息），圈出表型阳性的细胞或者计算平均荧光强度（mean fluorecence intensity，MFI），就可以得出这群细胞表达该抗原分子的情况。
大多数的表型分子都位于细胞表面，所以标记时只需要将抗体加入到样品细胞中即可。但有些位于细胞的内部，应先将细胞固定，用打孔剂在细胞膜表面开孔后，再加入荧光素偶联抗体，此时抗体就可以通过小孔进入细胞内部与细胞内的抗原结合。
流式分析的应用-细胞因子测定
细胞因子（cytokine）
是细胞合成和分泌的具有多种生物活性的低分子质量的多肽或蛋白质，一般在6-60kDa；
细胞因子的合成具有多源性，即不同细胞能够合成、分泌同一种细胞因子；
细胞因子其作用具有多向性，即同种细胞因子可以作用于不同细胞，发挥不同的生理功能；
细胞因子一般以自分泌或者旁分泌的方式发挥作用；
根据功能可以分为6大类：白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（inferferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factoer，TNF）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、趋化因子（chemokine）和生长因子（growth factoer、GF）。
检测方法
主要有三种方法：ELISA、胞内染色法、CBA（cytometric bead array）法。
流式分析的应用-细胞增殖检测
流式细胞术检测细胞增殖的方法有很多，根据待测细胞不同特征检测方法也不同，广泛使用的有相对计数法、示踪染料标记法和BrdU标记法。
相对计数法-原理/操作
细胞增殖最直接的结果就是细胞数目的增加，如果控制样品的体积一定，细胞数目的增加就是细胞浓度的增加，那么在相同的分析速度上样时，浓度大的样品单位时间内被检测到的细胞就越多（就是将对照组和各实验组控制在相同的条件下直接上样记录流式细胞仪事件数，或记录达到相同事件数的耗时，时间越短细胞浓度越大）。
相对计数法检测细胞增殖不仅得到相对数值，也可以得到绝对值。如在对照组、实验组中均加入1e5标记荧光的人工微球作为内参，该微球大小与细胞相当。用相对计数法同时可以计数该PE标记的人工微球，以计数得到的数值为基值，其他对照组和实验组的相对数值就可以根据此基值计算出各组的绝对数值。如低速上样60s计数得到荧光标记微球数为2000，那么相对数值2000就代表绝对值1e5，若实验组相对值测得5000，那么其绝对值就为2.5e5.
①对照组和实验组每种细胞所加的浓度必须相同，每组至少设置三个复孔，取平均数；
②收集各组的细胞于Ep管中，注意必须将各组的所有细胞都收集起来，然后标记需要计数细胞的荧光素偶联抗体，4℃下孵育30min；
③PBS重悬洗去游离的抗体，再用相同体积的PBS重悬沉淀，将细胞置于上样管中计数（上样前可加入7-AAD排除死细胞）；
④每个样品低速上样90s，计数目标细胞的数目（若加入内参，同时计数人工微球数）。
示踪染料标记法-原理/操作
示踪染料能够与细胞发生非特异性的不可逆性的结合，结合后相当稳定，不会被酶类降解。
其结合主要有两种机制：一种是能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合；另一种是能够非特异性地嵌入细胞膜的磷脂双分子层中与细胞膜发生非共价性结合。这些染料荧光信号非常强烈，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞的荧光信号就会减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例，就可以判断细胞增殖的强弱。
| 染料 | 标记机制 | 激发波长/nm | 发射波长/nm | 备注 |
| CFSE | 蛋白质结合 | 488 | 525 | 常用 |
| PKH67 | 细胞膜嵌入 | 488 | 502 | 常用绿荧光膜结合染料 |
用CFSE标记测定细胞增殖时，首先在目标细胞增殖前用CFSE标记，再将标记的细胞置于增殖体系中，细胞进行增殖时，母细胞中的CFSE会被平均分配到子细胞中，第二代子细胞CFSE浓度为原始浓度的一般，第三代只有1/4，以此类推，而CFSE的浓度与其激发后发射的荧光强度呈正比，所以可以通过分析增殖后细胞的荧光强度来计算增殖活性，荧光强度减弱到标记时的1/2以及以下的细胞都是增殖后的细胞，这些比例越高，细胞增殖越活越。
①将目标细胞浓度调整为1e6/ml，加入CFSE，标记浓度5μmol/L。置于37℃下孵育15min，孵育过程中每隔3min左右混匀细胞一次；
②加入预冷的培养基终止标记，4℃下孵育5min，之后离心；
③再用培养基洗涤一次，然后将目标细胞置于增殖体系中；
④增殖结束后，上样分析同一般样品；
BrdU掺杂法-原理/操作
5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸（bromodeoxyuridine,BrdU）是胸腺嘧啶核苷酸的类似物，特点是胸腺嘧啶环上5位C连接甲基被溴取代，在细胞增殖DNA合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷酸竞争掺杂到新合成的DNA中，而BrdU抗体可以特异性识别BrdU，不与胸腺嘧啶核苷酸结合，所以可以用于检测细胞增殖。
但BrdU掺杂法也有缺点：抗BrdU抗体分子过大，双链DNA中配对的碱基对会阻碍掺入的BrdU与荧光素的抗BrdU抗体的结合，因此为了暴露BrdU的表位，促进结合，目标细胞常需要经过DNA酶或者浓盐酸等强变性方法处理，这会给目标细胞带来不小的损伤。所以BrdU掺杂法一般只适用于体内检测目标细胞的增殖，例如将BrdU掺入小鼠的饮用水中或者经腹腔注射。
流式分析的应用-细胞凋亡检测
目前细胞死亡的方式主要有两种，细胞坏死（necrosis）和细胞凋亡（apoptosis）。免疫体系中主要区别：细胞坏死会释放出内容物，引起炎症反应，而细胞凋亡不会暴露内容物，一般被吞噬细胞清除。
流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法，既可以定性也可以定量，方法有很多种，以下主要介绍常用annexin V/PI双染色法。
Annexin V/PI 双染色法-原理/操作
正常细胞膜的磷脂分布是不对称的（细胞膜极性），活细胞中磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡/坏死时，细胞膜发生变化，极化现象消失（PS均匀分布于细胞膜内、外表面）。
Annexin V是一种对PS有高度亲和力钙依赖性的磷脂结合蛋白，可以特异性识别凋亡/坏死细胞表面的PS，而活细胞的PS位于细胞膜内表面，无法与其结合，所以可以用偶联FITC荧光的Annexin V鉴别死细胞和活细胞。
但是坏死细胞的PS也会从细胞膜内表面翻转到外表面，所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞，而PI染料能够与细胞内的DNA结合，能够区分坏死细胞和活细胞，凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法进入细胞内与DNA结合，所以PI无法标记凋亡细胞和活细胞，这样就需要两种染料联合使用来区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
操作方法与常规标记荧光抗体的方法一样：加入适量的Annexin V-FITC和PI染料，4℃/常温下孵育30min即可。
此外，用此方法检测细胞凋亡，在流式图设置象限，不能只根据对照所显示的阴阳性界限，而应该根据细胞群的具体分布设置。因为在某些情况下，如检测贴壁细胞的凋亡时，或操作过久等等外部条件导致一定程度的损伤细胞膜，从而使活细胞的膜内PS少量翻转到膜外，导致活细胞的FITC-Annexin V荧光信号整体向右移，应根据图形向右适量移动十字象限。
流式分析的应用-细胞周期检测
核酸荧光染料标记法-原理/操作
细胞周期就是细胞分裂产生新细胞开始到下一次分裂形成子细胞结束所经历的过程，主要分为G(0)期、G(1)期、S期、G(2)期、M期。细胞处于不同时期DNA含量不同，处于G(0)、G(1)期细胞含有二倍体量的DNA，处于S期DNA量在二倍体到四倍体之间，处于G(2)、M期细胞含有四倍体量的DNA。所以，可以利用非特异性核酸荧光染料与细胞内的DNA结合，产生流式细胞仪可检测到的荧光，通过区分荧光的强弱区分细胞处于哪一期。
| 染料名称 | 类别 | 特点 |
| PI（propidium iodide） | 细胞膜非通透性 | 应用广泛，使用前需增加细胞膜通透性并加入RNA酶降解RNA |
| 细胞膜通透性 | 标记效果好，但需紫激光激发 | |
| Hoechst33258、33342 | 细胞膜通透性 | 活细胞标记，但需紫激光激发 |
| AO（acridine orange） | 细胞膜非通透性 | 可具体区分细胞的5个周期 |
①配制低渗柠檬酸标记液：柠檬酸三钠0.25g、Triton-X-100 0.75ml、PI 0.025g、RNA酶0.0005g、再用双蒸水补至250ml；
②将目标细胞制成单细胞悬液，取2e6细胞离心，弃上清；
③加入1ml低渗柠檬酸标记液重悬，混匀，4℃下孵育30min；
④离心，弃上清，加入200μl PBS重悬混匀上样分析；
去除黏连体
实际样品中经常会出现粘连的双细胞或多细胞团块，而流式分析时可能将粘连在一起的两个二倍体细胞当作一个四倍体细胞，结果G(2)、M期比例会偏高，所以可以在样品处理过程中加入少量EDTA，减少细胞之间的粘连；流式分析时，可以将目标细胞显示在相应荧光通道的A（area）-W（Width）散点图中区分。
流式分析的应用-基因表达检测
在具有活性的单细胞水平上检测基因表达对于研究细胞的功能非常重要，能够应用于细胞工程系、细胞信号转导和功能基因组学等。流式检测活细胞内的基因表达要求能够正确指示目标基因转录的、敏锐的、没有毒性的荧光指示系统，其中常用的两个报告基因是编码绿色荧光蛋白的基因和编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ或β-内酰胺酶/CCF2指示系统。
绿色荧光蛋白指示基因系统-原理/操作
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是从水母Aequorea Victoria中提取的一种有内在荧光基团（internal fluorophore）的蛋白质，被488nm激光激发后能够产生507nm的荧光，其信号被FITC/FL1通道接收，编码该蛋白质的基因是常用的指示报告基因。
表达该蛋白非常简单只需要将编码GFP的基因整合到目标基因的启动子后面（pMAX-GFP、pcDNA3.1-GFP/EGFP等），当目标基因表达时也会同时表达GFP基因，表达后的GFP蛋白质积存于细胞内，细胞内GFP的量与目标基因的表达强弱成正比，检测到的荧光信号强弱间接反映目标基因的表达情况。
①构建质粒：在需要检测的目的基因启动子之后整合GFP/EGFP片段基因；
②利用各种转染的方式将质粒导入细胞内，按适宜的条件培养细胞；
③因细胞内含荧光指示蛋白，所以一般不需要其他荧光素标记染色，直接收取细胞离心，弃上清并用PBS重悬上样分析即可；
流式分析操作简单，对细胞刺激较小，但是GFP荧光信号较弱，一个细胞内至少需要表达 50 000-100 000个GFP分子，其产生的荧光信号才能被检测到（现构建质粒一般会选择强荧光信号的GFP蛋白异构体，S65T、V163A等）。因质粒转染的效率不可能达到100%，流式检测无法区分单个细胞是否转染成功。解决方法：在质粒载体中再加入一个对照基因，如DsRed，表达DsRed蛋白的细胞就是转染成功的细胞，然后分析表达GFP的细胞占所有表达DsRed细胞的比例即为目的基因表达的比例。
