（实验服务）实时荧光定量PCR

1. 服务概述

（实验服务）实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。作为分子生物学研究中的“金标准"技术，qPCR凭借其灵敏度、特异性和准确性，已成为基因表达分析、病原体检测及遗传变异研究的工具。

我们依托PCR检测平台，提供从样本核酸提取、逆转录、qPCR扩增到数据分析的一站式技术服务。无论您是需要检测mRNA、miRNA、lncRNA的表达水平，还是进行DNA拷贝数变异（CNV）分析，我们都能为您提供符合标准的高质量数据。

2. 技术原理与方法

我们提供两种主流的检测策略，满足不同实验需求：

• SYBR Green I 染料法：

• 原理： SYBR Green I 染料能特异性结合双链DNA的小沟，结合后荧光信号增强。随着PCR产物的增加，荧光信号同步增强。

• 适用： 基因表达差异初筛、大规模样本检测、成本敏感型项目。我们配合熔解曲线（Melt Curve）分析，确保扩增产物的单一性。

• TaqMan 探针法：

• 原理： 利用针对靶序列设计的特异性探针（5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团）。探针完整时无荧光，扩增过程中Taq酶的水解作用将荧光基团切离，发出荧光。

• 适用： 高特异性要求实验、多重PCR检测（Multiplex PCR）、SNP分型、微量样本检测。

3. 服务内容与全流程

我们严格遵循标准化操作程序（SOP），确保每一步骤的精准可控：

阶段一：实验设计与优化

• 引物/探针设计： 针对目的基因（Target Gene）设计跨内含子引物，避免基因组DNA污染干扰；筛选内参基因（Housekeeping Gene，如GAPDH, ACTB, 18S rRNA等）。

• 预实验验证： 通过普通PCR及琼脂糖凝胶电泳验证引物特异性，优化退火温度。

第二阶段：样本处理

• 核酸提取： 针对不同样本类型（细胞、组织、血液、外泌体等），采用专用试剂盒提取高质量的总RNA或DNA，进行浓度与纯度（OD260/280）检测及完整性评估。

• 逆转录（cDNA合成）： 针对mRNA使用Oligo(dT)或随机引物；针对miRNA使用茎环引物或加尾法，确保反转录效率均一。

第三阶段：上机检测

• 体系构建： 配置高保真qPCR反应体系，设置至少3个技术重复（Triplicates），消除加样误差。

• 程序运行： 实时采集荧光信号，生成扩增曲线。

第四阶段：数据分析

• 相对定量： 采用2−ΔΔCt法计算实验组相对于对照组的基因表达差异 fold change。

  
  

• 定量： 构建质粒标准品，绘制标准曲线，计算样本中目的基因的精确拷贝数。

  
  

4. 我们的核心优势

1. 硬件平台： 主流定量PCR仪，孔间差极小，数据稳定性高。

2. 严格质控体系： 遵循国际MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）指南。严格监测扩增效率（90%-110%）和线性关系（R²>0.99），杜绝假阳性/假阴性。

3. 复杂样本处理： 拥有丰富的FFPE切片、微量组织、外泌体及全血样本处理经验，有效去除PCR抑制剂。

4. 专业数据交付： 不仅提供原始Ct值，还提供扩增曲线图、熔解曲线图、相对表达量柱状图/热图，并生成包含详细实验材料与方法的完整报告，直接满足SCI发表要求。

5. 应用场景

• 基因表达水平分析： mRNA、lncRNA、circRNA在不同处理条件或疾病模型下的差异表达验证（RNA-seq后的qPCR验证）。

• miRNA检测： 微小RNA的表达调控研究。

• DNA拷贝数变异（CNV）： 肿瘤基因扩增或缺失检测、转基因拷贝数鉴定。

• SNP分型验证： 单核苷酸多态性位点的基因型鉴定。

• 病原微生物检测： 病毒载量测定、细菌定性定量分析。

• ChIP-qPCR： 染色质免疫沉淀后的DNA片段富集验证，研究蛋白-DNA相互作用。

6. 送样要求与交付标准

• 送样建议：

• 细胞： 细胞沉淀 > 

•  1*10^6，PBS清洗后速冻。

• 组织： 动物组织 > 50mg，植物组织 > 100mg，液氮速冻或RNAlater保存

• 血液： 全血需抗凝处理或直接提供分离好的血清/血浆。

• RNA/DNA： 浓度 > 50ng/μL，总量 > 1μg，干冰运输。

• 交付内容： 完整实验报告（含实验步骤、试剂信息）、原始数据文件（.eds/.xls）、数据分析结果图表（Excel统计表及高清图片）。