实时荧光定量PCR详细介绍

　　实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质实时监测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的技术，可对特定核酸序列进行定量分析。
 

　　一、检测原理
 

　　实时荧光定量PCR结合了PCR技术和实时荧光检测技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化。通过Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数)和标准曲线的分析，对起始模板进行定量分析。
 

　　二、荧光标记物
 

　　实时荧光定量PCR常用的荧光标记物包括荧光探针和荧光染料：
 

　　荧光探针：
 

　　TaqMan荧光探针：在探针的5'端设计有报告基团，3'端设计有淬灭基团。当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。在PCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变(SNP)。
 

　　分子信标：一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。当与核酸靶分子杂交后，构象发生变化而发出荧光。
 

　　荧光染料：
 

　　SYBR荧光染料：在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，该染料特异性地掺入DNA双链后，发出荧光信号，未掺入链中的SYBR染料分子不发出任何荧光信号。因此，PCR产物越多，荧光越强，荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR Green法可以用于各种扩增产物的定量，只要最后产物是双链DNA，这既是其主要优点，也是主要的缺陷，即不能区分扩增产物的特异性。
 

　　三、优势
 

　　与普通PCR相比，实时荧光定量PCR具有许多优点：
 

　　定量准确：克服了传统的基于反应产物进行定量的缺陷，避免了酶活性差异对定量结果的影响，使对原始模板的定量更准确，而且结果重现性好，定量范围宽。
 

　　操作简便：整个PCR过程可实现自动化，且耗时短，操作方便，不易污染。实时荧光定量PCR在加样后的过程完成闭管操作，不需要PCR后处理，使该技术更简单、更快速、操作更安全、假阳性率更低，因此结果更可靠。
 

　　结果直观：仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断的失误，结果数据可长期保存。
 

　　四、用途
 

　　实时荧光定量PCR可应用于多个领域：
 

　　病原体检测：常用于病毒载量测定，如乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等的定量分析。
 

　　基因表达分析：可比较不同组织或条件下特定基因的转录水平差异，研究基因表达的情况，即该基因在不同生理阶段的变化趋势。
 

　　遗传病诊断：能检测基因拷贝数变异，如脊髓性肌萎缩症的SMN1基因缺失。
 

　　肿瘤标志物检测：如乳腺癌HER2基因扩增分析。
 

　　其他领域：还可用于转基因成分鉴定、微生物群落定量、法医学、群体生物学及免疫学研究等。